Metodologia badań biologicznych: Barwniki stosowane do wybarwiania preparatów biologicznych.

Barwnik Manevala - jest to roztwór wodny zawierający 5% fenolu, 20% kwasu octowego, 30% chlorku żelaza (II) i 1% fuksyny. Roztwór ten, razem z czerwienią Kongo służy do wykrywania otoczek bakteryjnych metodą pozytywno-negatywna.

Sposób przeprowadzenia testu:

1. nanieść kroplę czerwieni Kongo na szkiełko
2. zrobić zawiesinę z hodowli bakteryjnej w kropli
3. rozprowadzić próbę i pozostawić do wyschnięcia
4. wkroplić na szkiełko barwnik Manevala i pozostawić go na 1 minutę
5. zlać barwnik i wysuszyć preparat bibułą

Po wykonaniu tego testu bakterie zabarwiają się na czerwono na skutek wchłonięcia do swojego wnętrza fuksyny, natomiast tło ulega zabarwieniu niebieskiemu na skutek reakcji wolnej czerwieni Kongo z barwnikiem Manevala. Otoczki bakteryjne pozostają niezabarwione. 

Błękit anilinowy (błękit bawełniany/ błękit metylowy) - jest to barwnik stosowany do wybarwiania preparatów biologicznych. Barwi on mniej lub bardziej bezbarwne elementy, np. zarodniki hialinowe, przez co zwiększa kontrast oraz ułatwia obserwację. Jest używane najczęściej w roztworze kwasu mlekowego. Stosowany jest także w akwarystyce do wybarwiania wody. 

Źródło: Wikipedia. Roztwór wodny błękitu anilinowego. 

Błękity toluidynowy - jest to organiczny związek chemiczny, pochodna 1,4-tiazyny, barwnik tiazynowy o charakterze soli. W temperaturze pokojowej jest to zielony proszek o brązowym połysku i słabym zapachu. Jest to istotny w histologii barwnik. Jest on polichromatyczny, tzn barwi ortochromatycznie w tej samej lub zbliżonej barwie niektóre struktury a inne metachromatycznie w barwie wyraźnie odmiennej, (np. elementy cytoplazmy komórek tucznych dają się wybarwiać błękitem toluidynowym metachromatycznie na czerwono - purpurowo gdy tło barwi się na niebiesko). Niebieski roztwór błękitu tolidynowego stosuje się w badaniach na obecność ligniny, która wiąże się z włóknami celulozowymi i wzmacnia oraz utwardza ściany komórkowe w roślinach, - wynik jest pozytywny przy zmianie zabarwienia z niebieskiego na różowy. (Podobny test jesteśmy w stanie przeprowadzić z roztworem chlorku fluoroglucynolu). Błękit toluidynowy uwidacznia struktury komórkowe przy barwieniu osadu moczu, oraz mastocytów w wycinkach skóry, ze względu na obecność heparyny w zasadochłonnych ziarnach w cytoplazmie. Dawniej błękit toluidynowy stosowano jako lek przeciwkrwotoczny przy przedawkowaniu heparyny i w krwawieniach zwł. z macicy, oraz środek diagnostyczny w badaniu tekstowym. Jednakże ze względu na objawy niepożądane błękitu toluidynowego ograniczyły jego stosowanie, i dziś stosowany jest m.in. do barwienia in vivo zmian śluzówki jamy ustnej jako badanie przesiewowe w celu wytypowania zmian do dalszej diagnostyki w kierunku raka jamy ustnej, podobnie śluzówki przełyku, dróg rodnych co do karcynogenności błękitu toluidyny rezultaty badań są sprzeczne. 

Źródło: Wikipedia. Przekrój oka ślimaka. Obraz mikroskopowy barwiony błękitem toluidynowym. VK = komora przednia, L = soczewka, R = siatkówka Sn = nerw wzrokowy. 

Czerwień Kongo - jest to związek organiczny z grupy barwników azowych, stosowany m.in. jako chemiczny wskaźnik pH. Zmiana barwy z niebieskiej (odczyn kwasowy) na czerwoną (odczyn zasadowy) następuje w zakresie pH 3,0-5,0. Ponieważ zmiana barw jest przeciwna do zmiany barw lakmusu, czerwieni Kongo używa się do wykonania żartobliwego doświadczenia chemicznego. Polega ono na zanurzeniu niebieskiego papierka lakmusowego (stosowanego do wykrywania odczynu kwasowego, pod wpływem którego zmienia barwę na czerwoną) do roztworu o odczynie kwasowym z dodatkiem czerwieni Kongo. Roztwór ten jest zabarwiony na niebiesko, a równie niebieski papierek lakmusowy zmienia barwę na czerwoną. Analogicznie użycie zasadowego roztworu z dodatkiem czerwieni Kongo (o czerwonej barwie) oraz czerwonego papierka lakmusowego (stosowanego do wykrywania odczynu zasadowego, pod wpływem którego zmienia barwę na niebieską) pozwala z zmienić kolor czerwony na niebieski w czerwonym roztworze. 

Czerwień Kongo umiarkowanie rozpuszcza się w wodzie z wytworzeniem roztworu koloidalnego. Silnie (lecz nie kowalencyjnie) wiąże się z włóknami celulozowymi, co wykorzystywano do barwienia materiałów zawierajacych celulozę (takich jak bawełna, drewno, papier). Ze względu na toksyczność i tendencję do zmiany barwy pod wpływem potu od dawna nie jest stosowany. 

Czerwien Kongo została otrzymana po raz pierwszy w 1883 przez Paula Bottigera pracującego dla firmy Bayer w Elberfeld w Niemczech. Bottiger poszukiwał wówczas barwnika do wyrobów tekstylnych, który nie wymagałby etapu zaprawiania. W związku z tym, że firma nie była zainteresowana jasnoczerwoną substancją zsyntetyzowaną przez Bottigera, opatentował on ją na swoje nazwisko i sprzedał firmie AGFA, która wprowadziła barwnik na rynek pod nazwą czerwień Kongo. Oczekiwano, iż nazwa ta wzbudzi szczególne zainteresowanie ze względu na odbywającą się Konferencję Berlińską poświęconą uregulowaniu europejskiego kolonializmu w Afryce. Ponieważ barwnik okazał się jednym z większych sukcesów komercyjnych AGFY, kolejne barwniki także zawierały w nazwie człon "Kongo", np. błękit Kongo, oranż Kongo, brąz Kongo i in. 

Eozyna - czerwony barwnik o charakterze kwasowym służący do wybarwiania zasadowych (acidofilnych lub kwasochłonnych, czyli lubiących kwasy) cząstek struktur komórek, takich jak cytoplazma, włókna kolagenowe, większość ziaren wydzielniczych w komórkach. Eozyna barwi te struktury na kolor czerwony. Zazwyczaj stosowana jest w połączeniu z hematoksyliną, barwiącą struktury kwasowe, czyli zasadochłonne (np. jądra, siateczkę śródplazmatyczną szorstką) na kolor niebieski. Barwnik będący połączeniem hematoksyliny i eozyny (tzw. H + E) należy do najczęściej stosowanych w histologii. Znane są dwa rodzaje związków określanych nazwą eozyna, tzn. eozyna Y i eozyna B. Najczęściej używaną jest eozyna Y, która ma lekko żółtawy odcień. Eozyna B natomiast jest związkiem o lekko niebieskim odcieniu. Różnice w barwieniach tymi związkami są nieznaczne i oba rodzaje mogą być stosowane do tego samego rodzaju barwień. Podobnie, jak inne barwniki z grupy ftalein, eozyna zawiera w jednej ze swych form dodatkowy pierścień laktonowy. 

Fuksyna - Fuksyna, zwana również Rozaniliną to mieszanina organicznych związków chemicznych z grupy barwników trifenylometylowych (trytylowych) i jednocześnie anilinowych, składająca się z chlorowodorków parazozaniliny (triaminotrytylu bez podstawników metylowych), rozaniliny (z jednym pierścieniem toluidynowym) i wyższych homologów zawierających 2 lub 3 pierścienie toluidynowe. Ma ona czerwony kolor i zielony, metaliczny połysk. Nazwa jej pochodzi prawdopodobnie od koloru kwiatów rodzaju fuksja. Została po raz pierwszy zsyntetyzowana w roku 1858 przez polskiego chemika - Jakuba Natansona jako jeden z pierwszych barwników syntetycznych. Jest ona otrzymywana przez utlenienie mieszaniny aniliny i toluidyny (metyloaniliny) za pomocą np. nitrobenzenu. Mieszanina metylowych pochodnych pararozaniliny jest znana jako fiolet metylowy. Jego głównym składnikiem jest pochodna pentametylowa, a zawiera także pochodne tetra - i heksametylowe. Ta ostatnia nosi nazwę fioletu krystalicznego. 

Fuksyna stosowana jest do wyrobu farb i atramentów oraz do barwienia papieru i włókien naturalnych (wełny, bawełny i jedwabiu). Jest mało odporna na działanie światła. Wykorzystywana także w chemii analitycznej: w postaci roztworu w lodowatym kwasie octowym do wykrywania azotynów, jako roztwór w rozcieńczonym kwasie solnym do wykrywania bromianów oraz w formie odbarwionej wodorosiarczynem sodu lub dwutlenkiem siarki do wykrywania bromków i aldehydów. Stosowana jest również jako barwnik w mikrobiologii w barwieniu metodą Grama do odróżnienia bakterii Gram - dodatnich od Gram - ujemnych (te ostatnie barwi na kolor różowy). Znajduje również zastosowanie w lecznictwie jako środek antyseptycznych (składowa Pigmentum Castellani). 

Hematotoksylina - jest to organiczny związek chemiczny, niebieski barwnik, który służy do wybarwiania zasadochłonnych (bazofilnych) struktur komórkowych, m.in. jądra, a jest on uzyskiwany z drewna modrzejca kampechiańskiego. W wyniku utlenienia, na przykład z chloranem potasu, przekształca się w hemateinę (o głębokim niebieskopurpurowym kolorze). W takiej formie używa się jej do barwienia cytologicznego tkanek wysyconych solami żelaza lub glinu. Hematoksylina w pH zasadowym barwi struktury komórkowe na kolor niebieski, natomiast w pH kwaśnym na czerwono. Zazwyczaj stosowana jest ona w połączeniu z eozyną - barwnikiem o charakterze kwasowym, reagującym z kwasochłonnymi (acydofilnymi lub eozynofilnymi) strukturami tkankowymi (których hematoksylina nie barwi). Jest to barwienie trwałe, w przeciwieństwie do barwienia tymczasowego (na przykład płynem Lugola). 

W latach 70 XX w. z powodu niedostatku drewna z lasów tropikalnych, w tym modrzejca kampechiańskiego wystąpiły znaczne braki hematoksyliny na rynku, które szybko dorpowadziły do wzrostu jej ceny. Spowodowało to znaczny wzrost kosztów diagnostyki laboratoryjnej i było impulsem do poszukiwania alternatywnych barwników cytologicznych i histologicznych. W ten sposób pojawił się cały szereg nowych substancji o zbliżonych właściwościach, np. błękit celestynowy, galocyjanina i galeina. Wszystkie one wymagają wcześniejszego wysycenia tkanki solami żelaza. 


Zieleń malachitowa - jest to organiczny związek chemiczny, syntetyczny barwnik zasadowy i pochodna trytylu. Jest stosowany do barwienia bawełny, wełny, jedwabiu, papieru, a także preparatów bakteryjnych. W akwarystyce wykorzystywana jest do leczenia chorób ryb, zwłaszcza ichtioftiriozy (ospy rybiej) - zaraźliwej i niebezpiecznej, a zarazem jednej z najczęstszych chorób słodkowodnych ryb akwariowych, która jest wywoływana przez kulorzęska (Ichthyophthirius multifiliis). U ryb pojawiają się białe punkciki. 

Zieleń malachitowa jest ponadto wskaźnikiem pH, przy pH 0,2-1,8 zmienia swą barwę z żółtej na zielononiebieską. Ponadto roztwór zieleni malachitowej i molibdenianu amonu jest odczynnikiem do wykrywania fosforanów. 

Zieleń malachitowa
pH < 0,2	⇄	pH > 1,8

W akwarystyce zieleń malachitowa jest stosowana od 1933 roku do zwalczania grzybów (Saprolegnia sp.) i pierwotniaków (głównie Ichthyophthirius multifiliis) atakujących ryby i ikrę. Stosuje się ją w kąpielach w postaci czystej lub mieszanki z innymi związkami, np. formalehydem, zielenią brylantową, fioletem krystalicznym, błękitem metylenowym. Tzw. preparat FMC jest mieszanką zieleni malachitowej z formaliną i błękitem metylenowym (3,5 g zieleni, 3,5 g błękitu na 1000 ml formaliny). Procedura kąpieli trwa zazwyczaj 3 dni, jednakże każdego dnia procedura musi być zaczynana od nowa. Stosuje się w celu kontroli pasożytów z rodzaju Cryptobia, Ichtyobodo, Chilodonella, Trichodina, Trichodinella oraz grzybicy skóry. 

Zieleń malachitowa i jej metabolit, zieleń leukomalachitowa, mogą się utrzymywać w organizmie ryb jadalnych przez dłuższy czas. W roku 2000 Unia Europejska zakazała stosowania zieleni malachitowej w hodowli ryb jadalnych ze względu na możliwość akumulowania się tego związku w organizmach ryb i potencjalnej toksyczności dla człowieka. W badaniach na zwierzętach oba te związki wykazywały właściwości karcynogenne i teratogenne.